快捷搜索:

自然—方法学》特写:无需标记的激光特技

  自然 - 方法论特征:没有影响的激光标记

  富含蛋白质的头发及其周围脂肪丰富的皮脂腺。通过受激拉曼散射收集图像,绿色代表脂肪,蓝色代表蛋白质。近期发表的“自然 - 方法论”发表专题文章 - “无标签激光特技”(激光技巧无标签)表示,非线性光学显微镜可以帮助科学家们在化学成分上看到活细胞和组织。文章内容如下:两年前,Annika Enejder在她的线虫脂肪储存研究中,遇到了一个令人费解的结果。荧光显微镜非常清楚地显示,当用他汀类药物处理这些蛔虫时,来自脂肪颗粒的信号将会减少。他汀类药物是广泛用于降低胆固醇的一类药物。但是,在同时进行的显微实验中,脂肪颗粒的直接观察没有显示出这样的变化。事实上,相干的反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜可以识别脂肪颗粒,这是荧光显微镜无法做到的。事实上,喂食常用尼罗红荧光染料的线虫将这种染料作为毒物处理:染料在脂肪颗粒周围的肠溶酶体颗粒中和非脂肪颗粒中分离。事实上,这种染料在其他方面是有误导性的:他汀类药物本身似乎影响其染色或荧光。来自瑞典查尔姆斯理工大学的Enejder说:“使用荧光基团时有很多错觉需要考虑,没有人能否认荧光探针的强度和细胞内行为检测的分子染色,但是这个标记仍然存在许多问题如何标记是一个问题,特别是对于整个生物体来说,一些标记物只能在已经死亡的细胞中起作用,另外一些则可以破坏细胞或者干扰研究中的生物过程,未标记的显微镜提供了一种实时观察技术,虽然有些技术仍然依靠内源性荧光基团,但基本上能够摆脱荧光技术,避免了光漂白的常见问题,而不是检测荧光团激发的光子,这些新技术检测到光吸收或改变,因为它通过生物样本。这种方法依赖于非线性光学在高光功率密度下观察到的过程。总之,激光脉冲可以用来“看”化学成分:脂质中的CH键,蛋白质中的酰胺键,还原或氧化态的生物分子,明胶蛋白或微管定期重复单位。当然,这种技术也有其自身的局限性:未标记的技术比识别单个分子的荧光标记更不敏感和特异。只有非常常见的群体没有被淹没在丰富样本产生的信号中。荷兰癌症研究所的生物物理学家Kees Jalink解释说:“这项技术的优点在于,您不需要任何标记,只需对其进行成像即可。 “但坏消息是,信号太弱,需要大量的能量来照亮一个细胞,而且可能只会得到一些细节。许多非线性模式除了CARS之外,其他可用的无标记手段包括双光子吸收,二次谐波产生(SHG)和受激拉曼散射,每种方法都有其自身的配置要求和优点,但这些方法不能在生物学家中迅速传播闪电。 ;短射光需要精确的瞄准,调整和整形;探头必须优化来拾取信号,留下背景。“这些仪器的组装需要丰富的专业经验;所有这些仪器都需要苛刻的条件,“加拿大不列颠哥伦比亚大学化学与工程系的Robin FB Turner说,仅仅是”必须每天重新校准“是不够的,Turner Turner表示,他有足够的理由来追踪这些技术:他想知道干细胞是如何分化成其他细胞的,何时何地没有比研究这个问题更好的办法。“我们选择了拉曼和CARS,因为他们能够在不损害细胞的情况下进行这种研究。“研究可以破坏细胞,并且在某个时间点只能获得瞬时状态;这些数据对于含有自发性细胞的异质细胞培养物并不是非常有用特纳补充说:“我们要跟踪细胞的生长”,同样的好处在组织层面的研究中也很突出,例如,哈佛大学的加里·鲁夫昆通过线虫诱导的RNA干扰来研究筛选的作用成千上万的脂质代基因,同时借助受激拉曼散射(SRS)技术被保护起来,叫做监测结果。合作者谢晓亮教授
Ruvkun也来自哈佛大约十年前,谢小亮发布了CARS显微镜,一种通过称为自发拉曼散射的现象来增强信号的技术,引起了巨大的轰动,在这种现象中,样品可以改变通过它的光的波长拉曼散射显微镜的早期使用需要高激光功率,有时需要一天的曝光时间。谢小亮和他的同事们证明,CARS可以用于活细胞研究。使用两束频率差等于化学键需要成像的振动频率的激光束,可以连续放大细胞产生的弱拉曼信号。谢小亮说:“它的灵敏度比自发拉曼散射的灵敏度高出几个数量级。但CARS也有缺陷。同时,它将重点放在拉曼光谱很短的一段时间内,限制了它可以获得的信号的数量;它也带来了很高的背景信号。从实际的角度来看,这些限制意味着大多数时候,如果CARS技术将被用于检测脂质,因为大量富集烃 - 氢键产生强烈的特征信号。谢小亮的兴趣已经转移到SRS上了,他是与他的团队成员闵伟和克里斯蒂安·弗洛伊德(Christian Freudiger)共同开发的一项技术,该技术于2008年出版。“在CARS,信号峰值发生了变化,”谢小亮解释说,不能使用现有的大量拉曼光谱数据进行化学鉴定“,他还表示,SRS通过快速准确地调制激光异​​常来消除背景噪声,这样不仅可以获得与传统拉曼光谱相同的光谱,但是信号强度要高出几个数量级,而且采集时间要比未放大的拉曼信号低得多。谢晓亮说,SRS产生的信号与振动化学键的数目是线性关系, SRS技术可用于实时观察:例如在制药和化妆品研究领域,观察到维生素A如何被滑雪板吸收ñ。 SRS技术也可用于观察酸或酶如何从植物细胞壁表面除去木质素,从而提高生物燃料生产效率。首先与辉瑞公司和哈佛大学的研究人员合作研究证实了谢小亮对该技术的原理有深入的了解。谢晓亮甚至预测,有一天SRS技术将取代CARS技术,但其他研究人员对此持保留意见。 SRS需要混合和解释来自多个光源的信号,光谱迭加也可能使解卷积变得困难。特纳说,他曾试图用SRS来观察溶液中的核酸,最后决定继续使用旧技术。用这些古老的技术,RNA可以从细胞的DNA中分离出来。他说,虽然拉曼显微镜可能会比较慢,但是使用SRS技术来扩展我们的知识是非常费劲的,几乎使用传统的拉曼技术。谢晓亮预测,一旦SRS被嵌入到商业系统中,它很快就会传播开来。他认为,这样的进展早在今年年底就会取得进展。据报蔡司和徕卡去年获得了执照。然而,就像荧光显微镜的警告一样,技术的扩散可能相当缓慢,第一台商用多光子显微镜于1996年发布; 2003年的一项调查发现,66%使用多光子显微镜的生物学研究仍使用定制系统现在商用多光子显微镜相当普遍2009年10月,谢晓亮的文章出现十年了,奥林巴斯宣布需要提供femtoCARS模块,可安装在多光子显微镜系统中。 2010年1月,纽波特公司展示了波长扩展单元,可以连接激光器和多光子显微镜,以支持CARS,SHG和其他成像模式。据悉,徕卡也将在下半年推出自己的产品。奥林巴斯产品经理YiWei(Kevin)Jia表示,他一直在帮助各个研究组织早在飞秒毫微微蜂窝模块上建立CARS系统,并且用于检测脂肪的模块使上手更容易。他表示,如果CARS产品的商品化类似多光子显微镜,销售可以在几年内实现一个大的飞跃,但目前CARS显微镜的大多数应用主要是物理实验室,并且使用自己的系统。然而,这些研究人员已经开始与生物学家一起工作,在普渡大学,生物医学工程教授程继新使用CARS快速找到细胞中的脂肪,然后用相同的光源切换到共焦拉曼,做更详细的化学成分分析近期有关人类前列腺癌细胞的研究发现,以前认为由脂肪组成的区域实际上是氧化的脂肪酸,下一步是检查这种脂肪酸是否可以用来标记前列腺癌的严重程度。在其他项目中,程继新开发了一个自动收集CARS信号来显示脂肪的平台,并使用一种称为和频生成的技术看具体蛋白质纤维。有了这项技术,程继新和他的合作者可以研究富含脂肪的免疫细胞如何嵌入血管壁的胶原蛋白基质中 - 这样的观察揭示了动脉粥样硬化的血块是如何形成的。程继新及其同事还独立监测了多发性硬化小鼠模型中的神经元髓磷脂,并指出轴突的某处存在损伤。他说:“我以前对活体组织中髓磷脂的监测还没有达到单细胞水平。 “Jalink说髓鞘形成特别适合用CARS成像,因为大量脂质的密集堆积,未标记的显微镜在其他应用中可能不那么容易使用,他说使用激光的研究人员经常会发现他补充道:“从技术上说,这是完全可行的,但为什么我应该用另一种方法来获得相同的信息来采用这种复杂而昂贵的技术呢? “一旦科技发展,研究人员将能够将其应用到新的层面,哥伦比亚大学的Rafael Yuste使用光学技术测量神经元电位,二次谐波成像(SHG)成像依赖于由这些分子具有很强的诱导偶极矩或特定的电荷分布,Yuste对神经元细胞膜等分子非常感兴趣 - 因为电场穿过它们,由于二次谐波信号与电场强度,就可以自动获得电压信号,问题在于很少有人可以做得很好,为了取得良好的效果,Yuste说:“你需要仔细扫描全谱以寻找潜力内源性二次谐波发色团“。他说开发这种技术依赖于跨学科的需求,研究人员在他们的边缘工作搜索字段。然而实际上,这样的工作往往得不到研究人员自己的部门的足够的资金和支持,这就是为什么更少的分子资源能够实现这个目标。Enejder等人认为跨学科可以帮助解决大量的问题,只能用非标记的非线性显微镜观察,尽管Enejder的背景是物理学,但她转向了生物学。因为更容易理解生物学家对于成像问题的看法,非线性光学如何提供帮助?她说,那些在物理系里坚定自己的眼睛可以继续优化技术,但是他们可能不了解生物学家真的很想看到:“我一点问题都没有,而且在我看来,随处可见应用” - 当这种交流越来越重要的时候,敢于尝试新的实验也变得重要 - 而且这些实验和物理学家以前的经验可能会有所不同,在一个创造弹性血管的生物工程项目中,Enejder及其同事希望监测植入纤维素基质的肌肉细胞的生长情况,Enedjer及其同事与CARS一起使用SHG观察植入他们很高兴地发现,他们可以监测植入的细胞如何与纤维素网接触并开始产生胶原纤维。这种方法可以极大地帮助确定最佳参数。 Enejder解释说,尽管植物纤维素SHG成像在纸上不可见,但细菌分泌的植物纤维素确实具有产生SHG信号的规则图案。 “只依靠别人说的话可以观察不行,你必须去尝试工作。”(陈涛,何娇/汇编报道)
 

您可能还会对下面的文章感兴趣: